高通量单细胞测序技术在肿瘤微环境研究中的应用

肿瘤组织并不是单纯一团恶性肿瘤细胞，而是由肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞、多种免疫细胞、细胞外基质共同构成的复杂复合组织，也就是肿瘤微环境。肿瘤内部不同细胞亚群基因突变、转录水平、功能状态各不相同，这种细胞层面的异质性，是肿瘤转移、耐药、免疫治疗失效的底层原因。过去批量组织测序，把成千上万细胞核酸混合检测，输出的是所有细胞的平均信号，稀有细胞亚群的信号会被大量普通细胞掩盖，很难捕捉到肿瘤内部真实细胞状态。

高通量单细胞 RNA 测序技术的出现打破了这一局限。技术流程主要包含组织解离，把实体肿瘤组织消化，分散成为单个悬浮细胞；之后对单个细胞进行捕获，给每一个细胞分配专属 DNA 条形码；完成反转录建库之后上机测序，最后依靠生物信息学解析每一个独立细胞的基因表达谱。科研人员可以基于基因表达特征，对细胞分群，识别组织当中存在的所有细胞亚型，找到稀有、特殊功能的细胞群体。

借助单细胞测序，科研人员可以深度解析肿瘤细胞内部异质性。同一肿瘤病灶内部，不同肿瘤细胞亚群驱动基因表达、增殖、侵袭能力存在巨大差别。单细胞转录组能够区分肿瘤内部不同恶性克隆，追踪肿瘤亚群的特征基因，找到介导侵袭转移的肿瘤细胞亚群。同时可以对比原发灶和转移灶的单细胞图谱，解析肿瘤转移过程当中细胞的转录重编程过程。

在肿瘤免疫微环境研究领域，单细胞测序发挥不可替代的价值。肿瘤组织当中浸润的 T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、树突状细胞存在大量功能分化。可以识别耗竭 CD8+T 细胞、组织驻留 T 细胞、促瘤 M2 巨噬细胞等特殊亚群，解析免疫细胞在肿瘤微环境当中发生功能抑制的分子通路。很多研究利用单细胞测序对比免疫治疗有效患者和无效患者肿瘤样本，挖掘和药物响应相关的特征细胞亚群以及特征基因，寻找新的治疗靶点以及预后生物标志物。

除此之外，单细胞测序可以用来识别耐药相关细胞亚群。经过药物处理之后，少量残留存活的微小残留病灶细胞，是肿瘤复发的源头。这类细胞占比很低，批量测序很难捕捉。单细胞测序可以捕获这些稀有耐药细胞，解析耐药细胞的转录特征，挖掘介导药物抵抗的关键通路，为开发逆转耐药的联合治疗方案提供线索。

当然该技术依旧存在不少现实短板。第一，样本处理门槛高，实体瘤解离的工艺会直接影响细胞活性，解离过程容易造成细胞应激，改变细胞转录本，带来实验偏差；第二，测序成本较高，大规模临床样本批量检测成本压力大；第三，单细胞测序产出海量数据，生物信息学分析难度大，对分析人员算力和专业度要求高；不同实验室之间数据分析流程不统一，样本之间结果比对存在障碍。

技术迭代也在持续推进，现在已经衍生出单细胞蛋白检测、空间单细胞测序等衍生技术，把细胞基因表达信息和组织空间位置信息结合，看清各类细胞在组织当中的分布位置以及细胞之间空间互作。随着测序成本持续下降，分析算法不断优化，单细胞测序会从基础科研，慢慢向临床转化方向延伸，助力肿瘤精准医学发展。