实验科普： RNA反转录

一、RNA模板制备

RNA是反转录的模板。总RNA通常用于RT-(q)PCR等下游应用的cDNA合成，而特定类型的RNA（如信使RNA（mRNA）、miRNA等小RNA）可通过富集而用于某些实验应用，如cDNA文库构建和miRNA图谱分析。

保持RNA的完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验过程中均需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液器移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对实验区域进行去污处理。

根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有多种RNA分离和纯化方法可供选择。分离纯化过程的主要目标是稳定RNA分子、抑制RNA酶，并通过适当的储存和提取方法最大程度提高产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及反转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。纯化的RNA应保存在-80°C，尽量减少反复冻融。

纯化后评估RNA质量和数量的方法有许多种。常用的方法是利用紫外光谱法检测特定波长的吸光度。RNA质量可通过利用Beer-Lambert定律测定260 nm处的吸光度而确定；不同波长的吸光度比值可以确定是否存在特定污染物（表1）。请注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波长的紫外线。对于需要更高RNA特异和更灵敏分析的RNA, 可以考虑使用含染料的荧光试剂，这种试剂只在特异性的与目标分子结合时才会释放荧光信号。